Imagerie

La plateforme apporte son expertise aux personnels de l’IMRB et aux utilisateurs extérieurs pour l’histologie et la microscopie. La plateforme d’imagerie est certifiée ISO 9001 depuis avril 2014. Cette certification garantie le suivi de règles de management de la qualité. La plateforme fournit le matériel depuis la préparation des échantillons jusqu’à l’observation en microscopie.
La plateforme se compose en 2 plateaux :

1) Plateau de préparation d’échantillon

2) Plateau de microscopie optique

1) Plateau de préparation d’échantillon

La plateforme met en œuvre un ensemble d’équipements permettant :

  • a) la préparation pour la microscopie optique
  • b) la préparation pour la microscopie électronique

 

a) Préparation pour la miscroscopie optique

La plateforme d’imagerie de l’IMRB fournit un service allant de la préparation de l’échantillon à la coupe et des équipements pour la coupe en paraffine ou en congélation. Ces équipements sont accessibles après formation et la réservation se fait par obm.inserm.fr.

 

  • La réalisation de blocs de paraffine à partir d’échantillons fixés
    Les tissus doivent être fixés au formol. La taille de l’échantillon ne doit pas excéder 4mm d’épaisseur sur 2cm de largeur et 2,5cm de longueur.
    La chaîne de préparation commence par la déshydratation et l’imprégnation en paraffine des échantillons. Ces étapes sont réalisées par un automate Milestone Logos afin d’obtenir une imprégnation optimale des échantillons. Une fois les échantillons imprégnés en paraffine, ils sont inclus en un bloc de paraffine grâce à une station d’enrobage Thermo Scientific HistoStar.
  • La réalisation de coupes
    Les coupes sont obtenues avec un microtome manuel Shandon Finesse 325 à partir de blocs en paraffine. Les coupes peuvent avoir une épaisseur de 3 à 30µm. Les coupes sont réalisées sur des lames soit Super-Frost + (pour l’immuno-histo), soit des lames sans traitement (pour une coloration histologique ultérieure).

De gauche à droite : automate d’imprégnation Logos, fontaine à paraffine HistoStar, microtome Shandon Finesse

Le personnel de la plateforme met à disposition un cryo-microtome Leica CM3050S et un microtome Shandon Finesse 325.  Le cryo-microtome Leica CM3050S permet des coupes à congélation jusqu’à -40°C pour une épaisseur de 5 à 100µm. Le microtome Shandon Finesse 325 permet des coupes en paraffine de 3 à 30µm. Le microtome est accompagné d’une plaque froide Histostar afin de refroidir et durcir les blocs et d’une plaque chauffante afin de lisser les coupes.

De gauche à droite : microtome Finesse et plaque froide, cryo-microtome.

– la coloration

La coloration se fait avec un automate ThermoScientific Gemini AS.
4 types de colorations sont proposées :
Hémalun de Mayer / éosine : les noyaux sont visibles en violet et le cytoplasme en rose
Rouge Sirius : le cytoplasme est jaune, les fibres de collagènes apparaissent en rouge
Periodic Acid Schiff (PAS) : les noyaux sont visibles en violet/bleu, les polysaccharides, glycogène, et les mucines en pourpre.
May-Grünwald Giemsa : les noyaux sont visibles en violet/bleu, le cytoplasme en rose, les granulations acides en bleu foncé, granulation basique en orangé les granulations neutres en lilas/violet

 

b) Préparation pour la microscopie électronique

La plateforme réalise aussi l’ensemble des opérations pour l’obtention de grilles en microscopie électronique en transmission.

 

  • préparation des blocs de résine EPON
    La fixation étant faite au glutaraldéhyde, le volume des tissus doit impérativement être de 1mmx1mmx1mm. Avant l’imprégnation en résine EPON, les échantillons sont soumis à une deuxième fixation au tetraoxyde d’osmium.
  • réalisation de coupes semi-fines
    Des coupes de 2µm sont faites puis colorées avec un mélange Azure II/bleu de méthylène. Elles permettent de sélectionner la zone d’intérêt afin de réaliser les coupes Ultra-fines.
  • préparation de grilles pour la microscopie électronique en transmission
    3 à 4 coupes de 60 à 150nm d’épaisseur sont déposées sur des grilles de cuivre. Après avoir été contrastées à l’acétate d’uranyle/citrate de plomb, les grilles sont prêtes pour l’observation.

Blocs de résine EPON contenant différents tissus apparaissant en noir.

Grilles pour la microscopie électronique en transmission

Les observations se font sur le microscope électronique en transmission JEOL 100CXII de la plateforme de microscopie du LISA. Pour cela contacter Patrick Hausset (Patrick.Ausset@lisa.u‑pec.fr).

http://www.lisa.univ-paris12.fr/fr/instruments/33-analytical-instruments-laboratory/117-microscopes .

2) Plateau de Microscopie Optique

Le plateau de microscopie optique est dédié à l’acquisition en microscopie de préparations histologique ou fluorescente.
Plusieurs microscopes sont disponibles :

  • a) Microscope Axioplan 2
  • b) Microscope AxioImager M2
  • c) Microscope confocal LSM 900
  • d) Microscope inversé AxioVert A1

a) Microscope Axioplan 2 :

Ce microscope est dédié à l’acquisition en “lumière blanche” pour l’histologie. Il est équipé d’une caméra Zeiss MRc pour l’obtention d’image couleur et d’une série d’objectif (Plan-NeoFluar x5/0,16 ; Acroplan x10/0,25 ; x20/0,45. Plan-Neofluar x40/0,75 ; x63/1,25 huile) pour un large choix de grandissement. Les acquisitions se font avec le logiciel Zeiss Zen 2012.

b) Microscope AxioImager M2 :

L’AxioImager M2 est dédié à la microscopie en fluorescence. Il est doté de 4 cubes pour la fluorescence (DAPI, A488/FITC, A547/TRITC, To-Pro3/Cy5) couvrant les molécules fluorescentes les plus utilisées en recherche biologique. Les images sont obtenues par la caméra monochrome Zeiss MRm. Les objectifs sont : Acroplan x10/0,25 ; x20/0,45 ; Plan-Neofluar x40/0,75. Le logiciel Zen 2012 pilote le microscope et la caméra.

c) Microscope confocal LSM 900 Airyscan 2 :

Le confocal est installé sur un microscope inversé Zeiss Axio Observer 7. Il est équipé d’une platine motorisée et d’une chambre thermostatée. Les diodes LASER (405 nm, 488 nm, 561 nm, 638 nm) permettent de couvrir un large éventail de molécules fluorescentes utilisées en biologie. Ce système permet l’étude de distribution de marqueurs fluorescents, de colocalisation, l’analyse spectrale (séparation des spectres de fluorescence) et des applications en cellules vivantes (vidéo-microscopie, FRAP) ainsi qu’une approche pour la super-résolution.

d) Microscope inversé AxioVert A1 :

Le microscope inversé est dédié à l’aquisition en phase et en couleur de cellules sur plusieurs types de support. Il est équipé d’une caméra Zeiss Axiocam 105 couleur et d’une série d’objectif à longue distance de travail (LD A-Plan 5x/0.15 Ph1, LD A-Plan 10x/0.25 Ph1, LD A-Plan 20x/0.35 Ph1, LD A-Plan 40x/0.55 Ph1). Les acquisitions se font avec le logiciel Zeiss Zen 2012.

Les documents, à destination des agents, mis à disposition par la plateforme d’imagerie se trouvent dans la bibliothèque de données de la page de la plateforme.

 

CONTACT : Nous contacter

 

La norme ISO 9001 définit une série d’exigences concernant la mise en place d’un système de management de la qualité dans un organisme, quels que soient sa taille et son secteur d’activité.

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